細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)凍(dong)存(cun)及復(fu)蘇(su)的(de)(de)基本(ben)原(yuan)則是慢(man)(man)凍(dong)快融，實驗證明這(zhe)樣(yang)可(ke)以大(da)限度(du)的(de)(de)保存(cun)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)活力。目細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)凍(dong)存(cun)多采(cai)用甘油或二甲基亞砜(feng)作保護劑(ji)，這(zhe)兩(liang)種物質能(neng)提(ti)高細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)膜對水的(de)(de)通透(tou)性，加(jia)上緩慢(man)(man)冷凍(dong)可(ke)使細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)內(nei)(nei)(nei)的(de)(de)水分(fen)滲(shen)出細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)外，減(jian)少細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)內(nei)(nei)(nei)冰(bing)晶的(de)(de)形成(cheng)，從而減(jian)少由于冰(bing)晶形成(cheng)造成(cheng)的(de)(de)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)損(sun)傷。復(fu)蘇(su)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)應采(cai)用快速融化的(de)(de)方(fang)法，這(zhe)樣(yang)可(ke)以bao證細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)外結晶在很短的(de)(de)時間內(nei)(nei)(nei)即融化，避(bi)免由于緩慢(man)(man)融化使水分(fen)滲(shen)入(ru)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)內(nei)(nei)(nei)形成(cheng)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)內(nei)(nei)(nei)再(zai)結晶對細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)造成(cheng)損(sun)傷。
細胞(bao)復(fu)蘇是一個簡(jian)單的試驗(yan)操作，但操作中也有許多需要注(zhu)意的事項，在(zai)實(shi)驗(yan)操作中注(zhu)意細小的問題，才能使復(fu)蘇后(hou)的細胞(bao)保持良好的狀態(tai)，針(zhen)對細胞(bao)復(fu)蘇應(ying)該注(zhu)意以下幾(ji)點：
1. 可以提把需要的(de)體積的(de)培養液放(fang)到培養瓶里(li)，擰松瓶蓋，放(fang)到孵箱里(li)30分鐘－－1個小(xiao)時；
2. 為防止(zhi)凍存管(guan)在(zai)升(sheng)溫時出現爆裂等情況，可(ke)以在(zai)放(fang)入水浴就(jiu)把超(chao)凈(jing)臺里的蓋子(zi)擰松一下(xia)然后(hou)再擰上；
3. 水浴溫度37℃左右。
一(yi)、凍(dong)(dong)存(cun)和復(fu)蘇的(de)原則：慢凍(dong)(dong)快(kuai)融(rong)
當細(xi)胞(bao)冷到零度(du)以下，可以產生以下變化：細(xi)胞(bao)器脫(tuo)水(shui)，細(xi)胞(bao)中可溶性(xing)物質濃度(du)升高，并在細(xi)胞(bao)內形成冰晶(jing)。
如(ru)果(guo)緩慢冷(leng)凍(dong)，可使細(xi)胞(bao)(bao)逐步脫水，細(xi)胞(bao)(bao)內不會產生大(da)的(de)冰晶(jing)；如(ru)果(guo)快速冷(leng)凍(dong)的(de)話，細(xi)胞(bao)(bao)內就會產生大(da)的(de)冰晶(jing)，大(da)結晶(jing)會造成(cheng)細(xi)胞(bao)(bao)膜、綱胞(bao)(bao)器的(de)損(sun)傷和破裂。復蘇過程應快融，目的(de)是防(fang)止(zhi)小冰晶(jing)形成(cheng)大(da)冰晶(jing)，即冰晶(jing)的(de)重(zhong)結晶(jing)。
二、慢凍程序
1. 標準(zhun)程序(xu)：采用(yong)細胞(bao)凍存(cun)器
當溫度在-25 ℃以上時，1~2 ℃/min；
當溫(wen)度達(da)-25 ℃以下時，5~10 ℃/min；
當溫度達(da)-100℃時，可(ke)迅速放入(ru)液氮中。
2. 簡易(yi)程序：將(jiang)冷凍管(guan)（管(guan)口要朝上）放(fang)入紗(sha)(sha)布袋(dai)內，紗(sha)(sha)布袋(dai)系以線繩，通過(guo)線繩將(jiang)紗(sha)(sha)布袋(dai)固定于(yu)液(ye)氮(dan)罐罐口，按每分鐘溫度下降1~2 ℃的速度，在(zai)40 min內降至液(ye)氮(dan)表(biao)面過(guo)夜，次日早(zao)晨(chen)投人液(ye)氮(dan)中(zhong)。
3. 傳統程序：冷凍管(guan)置于(yu)4℃ 10 分鐘→ -20℃ 30 分鐘→ -80℃ 16~18 小(xiao)時（或隔夜(ye)） → 液氮(dan)槽cahng期(qi)儲存。
三(san)、低溫保護劑的應用
在細胞凍(dong)存(cun)時加入溫保護劑，能大(da)大(da)提高(gao)凍(dong)存(cun)效果。
常用的(de)(de)低溫保(bao)護劑是(shi)DMSO，它是(shi)一種滲透性(xing)保(bao)護劑，可迅速透入(ru)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)，提高胞(bao)(bao)膜對水的(de)(de)通透性(xing)，降低冰(bing)點，延緩凍結(jie)過程，能使細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)內水分在(zai)(zai)凍結(jie)透出細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)外，在(zai)(zai)胞(bao)(bao)外形(xing)成冰(bing)晶，減少胞(bao)(bao)內冰(bing)晶，從(cong)而減少冰(bing)晶對細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)的(de)(de)損傷(shang)。
四、細胞凍存方(fang)法(fa)
1. 預先(xian)配制凍存液
（1）10%DMSO + 細胞(bao)生長液（20%血清+基礎培養液）
（2）10%甘油+ 細胞生長液（20%血清+基礎培養液）
2. 取對數(shu)生cahng期細胞(bao)，經(jing)胰酶消化后，加入適量凍存液， 用吸管吹(chui)打制(zhi)成細胞(bao)懸(xuan)液（1×106 ~ 5 ×106細胞(bao)/ml）。
3. 加(jia)入1 ml細(xi)(xi)胞于(yu)凍存管中，密封后標記冷凍細(xi)(xi)胞名稱和冷凍日期(qi)。液氮chang期(qi)保存。
五、保存細胞的復蘇(su)方法
1. 快(kuai)速解凍
凍存細胞從(cong)液氮中取出后，立即(ji)放入37℃水浴(yu)中，輕輕搖(yao)動冷凍管(guan)，使其在1 分鐘(zhong)內(nei)全部融化（不要超過(guo)3 分鐘(zhong)）。
2. 解凍后的細(xi)胞可直(zhi)接(jie)(jie)接(jie)(jie)種(zhong)到生長培(pei)養(yang)液(ye)的細(xi)胞培(pei)養(yang)瓶中直(zhi)接(jie)(jie)進(jin)行培(pei)養(yang)，24小(xiao)時后再(zai)用新鮮(xian)培(pei)養(yang)液(ye)替換舊培(pei)養(yang)液(ye)，以去除DMSO。
3. 如果細胞對冷凍保護劑特別敏感
解凍后的細胞(bao)應先(xian)通(tong)過離心去除冷(leng)凍保(bao)護劑，然(ran)后再接種到生長(chang)培養液的培養瓶中。
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