恒遠生物(wu)主要經營科研試(shi)劑產(chan)品(pin)，現擁有各物(wu)種基因(yin)產(chan)品(pin)50余萬種；重組蛋白20余萬種；數(shu)十個種屬的多(duo)克隆抗體(ti)3萬多(duo)種和(he)高質量單克隆抗體(ti)數(shu)百(bai)種。恒遠品(pin)牌(pai)自主研發ELISA試(shi)劑盒，現已涵蓋(gai)20多(duo)個種屬，數(shu)千(qian)種產(chan)品(pin)，涉及腫瘤、激素、自身(shen)免疫、心(xin)血管、代謝等(deng)十多(duo)個研究(jiu)域。本周小編給(gei)大家帶來的是：WB實驗結果——膜上一片空白，到底是什么原因(yin)導致(zhi)的呢？一起來看(kan)看(kan)吧(ba)！
一、膠(jiao)和(he)膜(mo)放反了：如(ru)果(guo)在轉印的(de)過程中，膠(jiao)和(he)膜(mo)的(de)位置(zhi)顛倒了，那么蛋白就從膠(jiao)上轉移到緩(huan)沖液中，而不會到達膜(mo)上。對于標(biao)準的(de)轉印，凝膠(jiao)應靠近三明治的(de)負(fu)，而膜(mo)對應正。
二、轉(zhuan)(zhuan)(zhuan)(zhuan)膜(mo)效(xiao)率(lv)低：轉(zhuan)(zhuan)(zhuan)(zhuan)膜(mo)效(xiao)率(lv)受多(duo)種因(yin)素影(ying)響，包括蛋(dan)白(bai)(bai)的(de)大小、凝膠中丙烯(xi)酰胺的(de)百分比、電(dian)場(chang)強(qiang)(qiang)度、轉(zhuan)(zhuan)(zhuan)(zhuan)印時(shi)間和(he)緩(huan)沖(chong)(chong)液的(de)PH值(zhi)。一(yi)般來說(shuo)，蛋(dan)白(bai)(bai)越大，轉(zhuan)(zhuan)(zhuan)(zhuan)移(yi)的(de)越慢。轉(zhuan)(zhuan)(zhuan)(zhuan)移(yi)大蛋(dan)白(bai)(bai)的(de)方法是(shi)用(yong)高(gao)的(de)電(dian)場(chang)強(qiang)(qiang)度。而小蛋(dan)白(bai)(bai)長時(shi)間處(chu)于(yu)高(gao)電(dian)場(chang)強(qiang)(qiang)度下可能會(hui)傳出轉(zhuan)(zhuan)(zhuan)(zhuan)印膜(mo)。避(bi)免這(zhe)個(ge)問題的(de)方法是(shi)用(yong)0.2μm孔徑(jing)的(de)PVDF膜(mo)進行轉(zhuan)(zhuan)(zhuan)(zhuan)印。如(ru)果(guo)蛋(dan)白(bai)(bai)的(de)等電(dian)點接近(jin)緩(huan)沖(chong)(chong)液的(de)pH值(zhi)，那(nei)么這(zhe)個(ge)蛋(dan)白(bai)(bai)攜帶的(de)電(dian)荷很少，在電(dian)場(chang)中頁(ye)幾乎不移(yi)動。如(ru)果(guo)你(ni)的(de)目的(de)蛋(dan)白(bai)(bai)是(shi)強(qiang)(qiang)堿性的(de)，那(nei)么你(ni)可以用(yong)碳酸鹽(pH9.9)、CAPS(pH11)及酸性緩(huan)沖(chong)(chong)液。
三、試(shi)劑放(fang)置太久或存放(fang)條件不(bu)正確(que)：抗體會(hui)慢慢降(jiang)解，如(ru)果(guo)反復凍融的話，它會(hui)快速降(jiang)解。底物應儲存在-20℃。
四(si)、抗(kang)(kang)體不純或滴度(du)太低：一(yi)抗(kang)(kang)的(de)濃度(du)差異很大(da)，應該根據(ju)經(jing)驗來決定(ding)一(yi)抗(kang)(kang)的(de)稀釋度(du)。一(yi)般的(de)原(yuan)則是以(yi)1：100-1:1000來稀釋血清(qing)或組織培養(yang)上清(qing)，以(yi)1：1000-1：10000來稀釋腹水或超免疫(yi)動物的(de)血清(qing)。Bio-Rad的(de)印跡別的(de)二抗(kang)(kang)稀釋度(du)是1：3000。
五、酶(mei)失活(huo)了：疊(die)氮(dan)鈉(na)是辣根過氧化(hua)物酶(mei)的抑制(zhi)劑。不要(yao)再HRP顯色的western blot中使(shi)用(yong)任何(he)含疊(die)氮(dan)鈉(na)的試劑。疊(die)氮(dan)鈉(na)可以用(yong)于堿性磷酸酶(mei)結(jie)合的抗體中,另外，只能使(shi)用(yong)蒸餾的去離子水。
六、使用(yong)Tween-20洗滌：Tween-20(吐溫-20)可能(neng)會干擾某些抗體-抗體相互作(zuo)用(yong)，或洗去(qu)PVDF膜上的(de)目(mu)的(de)蛋白。因(yin)此除了封閉之(zhi)后(hou)的(de)diyi次洗滌，其他洗滌過程(cheng)中都(dou)不使用(yong)Tween-20。
七、檢測系統缺乏(fa)足夠的靈敏度：確保(bao)蛋白的上樣量在(zai)檢測系統的靈敏度范圍內。
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